Honokiol induz apoptose | Grupo de pentes de ponta de Guangdong

Parasitas e Vetores volume 16, Número do artigo: 287 (2023) Citar este artigo

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Cryptocaryon irritans, um parasita comum em peixes teleósteos marinhos tropicais e subtropicais, causou sérios danos à indústria da aquicultura marinha. Foi comprovado que o Honokiol induz o encolhimento e a morte do citoplasma de C. irritans tomont em nosso estudo anterior, mas o mecanismo pelo qual ele funciona permanece desconhecido.

Neste estudo, as alterações na morfologia apoptótica e na proporção apoptótica foram detectadas por observação microscópica e coloração com AnexinaV-FITC / PI. Os efeitos do honokiol na concentração intracelular de cálcio ([Ca2+]i), potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm), espécies reativas de oxigênio (ROS), quantidade de fragmentações de DNA (QDF) e atividades de caspases foram detectados pela coloração Fluo-3, JC-1 coloração, coloração DCFH-DA, método Tunel e kit de ensaio de atividade de caspase. Os efeitos do honokiol nos níveis de expressão de mRNA de 61 genes relacionados à apoptose em tomonts de C. irritans foram detectados por PCR em tempo real.

Os resultados do estudo sobre os efeitos da concentração de honokiol na morte semelhante à apoptose de C. irritans tomont mostraram que os níveis mais altos de taxa de mortalidade semelhante à apoptose da prófase (PADR), concentração de [Ca2 +] i, ROS, as atividades da caspase-3 /9 e a menor razão de necrose (NER) foram obtidas na concentração de 1 μg/ml, considerada a mais adequada para induzir morte semelhante à apoptose de C. irritans tomont. Quando C. irritans tomonts foram tratados com 1 μg/ml de honokiol, a concentração de [Ca2+]i começou a aumentar significativamente em 1 h. Depois disso, as ERO, QDF e atividades da caspase-3/9 começaram a aumentar significativamente, e o ΔΨm começou a diminuir significativamente às 2 h; o maior PADR foi obtido às 4 h. A expressão de mRNA de 14 genes foi significativamente regulada positivamente durante o tratamento com honokiol. Destes genes, itpr2, capn1, mc, actg1, actb, parp2, traf2 e fos foram enriquecidos na via relacionada à apoptose induzida pelo estresse do retículo endoplasmático (ER).

Este artigo mostra que o honokiol pode induzir a morte semelhante à apoptose de C. irritans tomont. Estes resultados sugerem que o honokiol pode perturbar a homeostase de [Ca2+]i no RE e então induzir a morte semelhante à apoptose de C. irritans tomont pela cascata de caspases ou via mitocondrial, o que pode representar uma nova intervenção terapêutica para a infecção por C. irritans.

Cryptocaryon irritans, um protozoário parasita comum de peixes teleósteos marinhos, causa a doença da “mancha branca” [1]. Esta doença é prevalente principalmente em áreas marítimas tropicais e subtropicais [2,3,4]. Seu ciclo de vida inclui quatro estágios: trofonte, protomont, tomont e theront [5]. Tomont é o estágio de vida livre mais duradouro de C. irritans. Os Tomonts têm forte resistência a drogas e ambientes agressivos devido aos seus cistos duros. Tomonts ainda podem produzir theronts infecciosos após serem preservados a 12 ° C por 3 meses [5]. É difícil remover completamente C. irritans tomonts em um ambiente de maricultura aberto, o que torna muito difícil a prevenção e o controle da doença da mancha branca. É uma boa estratégia para prevenir e tratar parasitas induzindo a sua morte espontânea; isto tem as vantagens de baixa probabilidade de resistência aos medicamentos e inflamação do hospedeiro. É bem conhecido que a apoptose é um processo altamente regulado de morte celular [6]. Nos últimos anos, a apoptose proporcionou um novo tratamento para muitas doenças, como inflamação, câncer, leishmaniose, malária e toxoplasmose [7,8,9,10,11,12,13,14]. A via de morte semelhante à apoptose também foi encontrada em muitos protozoários, como Leishmania, Plasmodium falciparum, Tetrahymena thermophila, Trypanosoma cruzi, Blastocystis hominis, Toxoplasma gondii e Ichthyophthirius multifiliis [12,13,14,15,16,17,18 ,19,20,21], proporcionando uma nova forma de tratar doenças parasitárias. Muitos genes de C. irritans relacionados à apoptose foram encontrados através da análise do transcriptoma [22,23,24,25,26], o que indica que C. irritans pode ter uma via de morte semelhante à apoptose. Foi relatado que Honokiol, um dos principais componentes ativos da Magnolia officinalis, induz a apoptose de células cancerígenas e Candida albicans através da via de estresse do retículo endoplasmático (ER) [27,28,29,30]. Nossos estudos anteriores demonstraram que o honokiol inibiu significativamente a proliferação e a eclosão de tomonts C. irritans. O citoplasma resultante de C. irritans tomont obviamente encolheu sem danos ao citoplasma ou à membrana celular [31], indicando que o honokiol pode induzir morte semelhante à apoptose de C. irritans tomont. No entanto, são necessárias mais experiências para confirmar esta especulação, e o mecanismo continua por descobrir.

4.0 μg/ml, the treated C. irritans tomonts' cytoplasms were irregularly condensed, became hyaline, and were stained by PI (showing red fluorescence), which indicates their cell membranes were damaged (a typical characteristic of middle- and late-stage cell apoptosis or necrosis). Four-quadrant apoptosis diagrams are given in Fig. 2, showing that with the increase in honokiol, the PADR began to increase at a concentration of 0.6 μg/ml. It reached its highest level when the honokiol concentration was 1.0 μg/ml and then decreased, while the AADR and NER began to increase at a concentration of 2.0 μg/ml./p> 4.0 μg/ml, the treated C. irritans tomonts’ cytoplasms were irregularly condensed, became hyaline, and were stained by PI. a–f: Morphologies of C. irritans tomonts respectively treated with 0.0, 0.6, 1.0, 2.0, 4.0, and 8.0 μg/ml honokiol for 8 h. g–l: Morphologies of C. irritans tomonts respectively treated with 0.0, 0.6, 1.0, 2.0, 4.0, and 8.0 μg/ml honokiol for 8 h and observed at Ex/Em = 488/525 nm. m–r: Morphologies of C. irritans tomonts respectively treated with 0.0, 0.6, 1.0, 2.0, 4.0, and 8.0 μg/ml honokiol for 8 h and observed at Ex/Em = 488/630 nm. s–x: Overlapping morphology photos of C. irritans tomonts respectively treated with 0.0, 0.6, 1.0, 2.0, 4.0, and 8.0 μg/ml honokiol for 8 h and recorded at Ex/Em = 488/525 nm and Ex/Em = 488/630 nm. All bars = 300 μm/p> 4.0 μg/ml. As shown in Fig. 3B, the ΔΨm decreased to a level significantly lower than that of the control sample when the honokiol concentration was > 0.6 μg/ml. As shown in Fig. 3C, with the increase of the honokiol concentration, the ROS increased to a level significantly higher than that of the control sample at 1.0 μg/ml and then returned to the level of the control sample. As Fig. 3D shows, with the increase of the honokiol concentration, the QDF began to increase at 0.6 μg/ml, increased to a level significantly higher than that of the control sample at 1.0 μg/ml, reached the highest level at 2.0 μg/ml, and then decreased, but the level remained significantly higher than that of the control sample when the honokiol concentration increased above 4.0 μg/ml. As shown in Fig. 3E, with the increase of the honokiol concentration, both the caspase-3/9 activities began to increase to levels significantly higher than those of the control sample at 0.6 μg/ml and reached the highest levels at 1.0 μg/ml. The activity of caspase-3 gradually returned to the level of the control sample when the honokiol concentration was ≥ 4.0 μg/ml, while the activity of caspase-9 remained at a level higher than that of the control sample, and the activity of caspase-8 always remained at the level of the control sample./p>