Fatores de sinal difusíveis (DSFs) ligam e reprimem VirF, o principal ativador de virulência de Shigella flexneri

Scientific Reports volume 13, Artigo número: 13170 (2023) Citar este artigo

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Shigella, o agente etiológico da disenteria bacilar humana, controla a expressão de seus determinantes de virulência através de uma cascata de ativadores transcricionais estimulada ambientalmente. VirF é o principal ativador e é essencial para a expressão adequada da virulência. Neste trabalho relatamos experimentos in vitro e in vivo mostrando que dois autoindutores da família DSF, XcDSF e BDSF interagem com o módulo jelly roll do VirF causando sua inibição e afetando a expressão de todo o sistema de virulência da Shigella, incluindo seu capacidade de invadir células epiteliais. Propomos um modelo molecular que explica como a ligação do XcDSF e do BDSF causa a inibição do VirF, evitando a sua dimerização. No geral, os nossos resultados experimentais sugerem que o XcDSF e o BDSF podem contribuir para a “resistência à colonização” no intestino humano ou, alternativamente, podem ser explorados para o ajuste fino da expressão da virulência da Shigella à medida que a bactéria migra do lúmen para se aproximar da mucosa intestinal. Nossas descobertas também enfatizam como uma compreensão detalhada da interação dos ligantes do DSF com o VirF pode contribuir para o desenvolvimento racional de medicamentos antivirulentos inovadores para tratar a shigelose.

Shigella é uma bactéria Gram-negativa enteropatogênica responsável pela shigelose, doença que afeta cerca de 125 milhões de pessoas anualmente em todo o mundo, com desfecho fatal em aproximadamente 164 mil casos1,2. Para infectar a mucosa intestinal humana, a Shigella explora um Sistema de Secreção Tipo III específico (T3SS) para promover a invasão bacteriana através da injeção de uma série de fatores no citoplasma da célula hospedeira3. Os genes que codificam o componente proteico deste T3SS, os fatores envolvidos na sua montagem e os efetores injetáveis ​​estão agrupados em uma região semelhante a uma grande ilha de patogenicidade (PAI) dentro do plasmídeo de virulência de Shigella (pINV)4. A expressão dos genes T3SS é controlada por uma cascata regulatória desencadeada pelo regulador transcricional AraC-XylS VirF, que fica no topo da cascata . A proteína VirF promove a transcrição de dois genes críticos para a virulência da Shigella, icsA e virB. A proteína IcsA está envolvida na motilidade bacteriana intracelular7,8 e a proteína VirB, atuando como segundo regulador positivo do sistema de virulência, é responsável pela expressão dos níveis subjacentes da cascata reguladora da Shigella9,10. Digno de nota, os genes virF, virB e icsA são genes do plasmídeo pINV localizados fora da região semelhante ao PAI. O VirF é regulado no nível transcricional por diversos estímulos ambientais, como temperatura, pH e osmolaridade, e no nível pós-transcricional pelo MiaA10. Muito recentemente, demonstramos que a atividade do VirF é diretamente controlada também pelos ácidos graxos (FAs)11. Em particular, FAs como os ácidos láurico, cáprico, miristoleico, palmitoleico e sapiênico ligam-se ao VirF e inativam sua atividade promotora da transcrição, provavelmente fazendo com que a estrutura da proteína mude de um estado livre e funcional (“aberto”) para um estado ligado ao FA. , forma não funcional (“fechada”). Um mecanismo semelhante envolvendo FAs foi proposto anteriormente para outros reguladores de virulência, como ToxT de V. cholerae, Rns de E. coli enterotoxigênica (ETEC) e HilD de Salmonella enterica12,13,14. Recentemente, o ácido cis-2-hexadecenóico foi incluído entre os ligantes que se ligam e inibem a HilD, influenciando assim a expressão do gene de virulência de S. enterica . Este composto pertence a uma classe rara de FAs, sintetizados por bactérias Gram-negativas, chamados “fatores de sinal difusíveis” (DSFs). Os DSFs incluem FAs com diferentes comprimentos de cadeia e padrões de ramificação com uma ligação cis insaturada na posição 2, exceto para o ácido 13-metiltetradecanóico (LeDSF). Além disso, foi demonstrado que os DSF servem como moléculas de sinalização em sistemas bacterianos de detecção de quorum (QS) e regulam várias funções em uma ampla gama de bactérias, incluindo patógenos de plantas e animais . Um protótipo da molécula de DSF é o ácido cis-11-metil-2-dodecenóico (XcDSF) produzido pela bactéria fitopatogênica Xanthomonas campestris17,19. Outros membros importantes da família DSF, previamente caracterizados, incluem o ácido cis-2-decenóico (PDSF); ácido cis-2-dodecenóico (BDSF); ácido cis, cis-11-metildodeca-2,5-dienóico (CDSF); ácido cis-10-metil-2-dodecenóico (IDSF); ácido cis-2-tetradecenóico (XfDSF1); e ácido cis-2-hexadecenóico (XfDSF2). As bactérias que sintetizam DSF fazem parte de uma lista constantemente atualizada e são caracterizadas pela presença do gene rpfF (ou um homólogo deste), crucial para a síntese de DSF . Até o momento, a lista de produtores de DFS inclui Xanthomonas spp., Xylella fastidiosa, Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia, Lysobacter enzimogenes e brunescens, Leptospirillum ferrooxidans, Burkholderia cenocepacia e Cronobacter turicensis17. Bactérias pertencentes aos gêneros Frateuria, Luteobacter, Pseudoxhantomonas e Rhodanobacter também podem ser incluídas com base na predição in silico17. O locus gênico responsável pela produção de DSFs e seu reconhecimento como sinal de detecção de quorum foi caracterizado pela primeira vez em X. campestris e inclui quatro genes, rpfC, rpfG, rpfB e rpfF18,21,22. RpfC e RpfG formam um sistema de dois componentes, enquanto RpfB é uma ligase para moléculas de acil-CoA de cadeia longa. RpfF é uma enzima da superfamília crotonase (atividades enoil-CoA desidratase e tioesterase) e atua sobre uma proteína transportadora de acila (acil-ACP), um intermediário da síntese de ácidos graxos, para sintetizar XcDSF. Quando a população bacteriana atinge uma densidade crítica, o XcDSF interage com o sensor RpfC induzindo a fosforilação da proteína reguladora de resposta RpfG. Devido à sua atividade hidrolítica, o RpfG fosforilado converte o segundo mensageiro bis-(3'-5')-GMP cíclico (c-di-GMP) em GMP. Uma diminuição do c-di-GMP intracelular leva à desregulação dos genes alvo18. Em Burkholderia cenocepacia, a biossíntese de moléculas de DSF (BDSF) é inteiramente dependente de RpfFBc, uma enzima bifuncional com atividade de enoil-CoA hidratase e tioesterase. Esta enzima exibe uma identidade de sequência significativa com a proteína RpfF de X. campestris. Apesar da alta similaridade entre XcDSF e BDSF na via biossintética e na estrutura química, o mecanismo pelo qual B. cenocepacia detecta BDSF difere daquele caracterizado em X. campestris por envolver um receptor citoplasmático, a proteína RpfR. Esta enzima exibe atividade cíclica di-GMP fosfodiesterase uma vez ligada ao BDSF, causando assim a diminuição do c-di-AMP citoplasmático . Curiosamente, este mecanismo de reconhecimento e regulação assemelha-se muito à interação entre HilD e ácido cis-2-hexadecenóico, que causa a supressão da virulência de S. enterica. Considerando a alta similaridade estrutural entre XcDSF, BDSF e ácido láurico (Fig. S1), um inibidor previamente caracterizado da atividade de VirF, perguntamos se XcDSF e BDSF poderiam inibir a virulência de Shigella, prevenindo a atividade promotora de transcrição da proteína VirF. No presente estudo mostramos, por meio de experimentos in silico, in vitro e in vivo, que XcDSF e BDSF interagem diretamente com VirF, levando a uma diminuição significativa na transcrição de virB, dificultando assim a expressão de todo o sistema de virulência de Shigella e causando uma fenótipo defeituoso caracterizado por invasão insuficiente de células hospedeiras e por proliferação retardada dentro delas.