A escolha do iniciador do gene 16S rRNA impacta

Scientific Reports volume 13, Artigo número: 12577 (2023) Citar este artigo

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O sequenciamento do amplicon 16S rRNA ou, mais recentemente, a análise metatranscriptômica são atualmente os únicos métodos preferidos para o perfil microbiano de amostras contendo uma proporção predominante de DNA humano para bacteriano. No entanto, devido à amplificação fora do alvo do DNA humano, os protocolos atuais são inadequados para amostras biópticas. Aqui apresentamos um método eficiente, confiável e acessível para a análise de bacterioma de amostras clínicas. O conteúdo de DNA humano predomina. Determinamos o perfil da microbiota em um total de 40 biópsias humanas de esôfago, estômago e duodeno usando sequenciamento de amplicon 16S rRNA com os iniciadores 515F-806R (V4) amplamente utilizados visando a região V4, iniciadores 68F-338R e um conjunto modificado de Iniciadores 68F-338R (V1-V2M) direcionados à região V1 – V2. Com os iniciadores V4, em média 70% das variantes da sequência de amplicon (ASV) foram mapeadas para o genoma humano. Por outro lado, esta amplificação fora do alvo estava ausente quando se utilizaram os iniciadores V1 – V2M. Além disso, os primers V1 – V2M forneceram riqueza taxonômica e reprodutibilidade de análise significativamente maiores em comparação com os primers V4. Concluímos que o método de sequenciamento de rRNA V1 – V2M 16S é confiável, econômico e aplicável para amostras humanas com baixo teor bacteriano abundante em pesquisas médicas.

Na última década, a investigação do bacterioma humano usando métodos de sequenciamento de alto rendimento independentes de cultura tornou-se uma das técnicas mais utilizadas para estudar comunidades bacterianas que habitam uma ampla variedade de nichos no corpo humano . O acesso a tecnologias de terceira geração, juntamente com a diminuição dos custos associados ao sequenciamento de alto rendimento, resultou em uma mudança do sequenciamento do gene 16S rRNA do amplicon para o sequenciamento do gene 16S rRNA completo e sequenciamento metagenômico/metatranscriptômico em amostras como fezes, vagina humana3 ou esfregaços de a pele ou a cavidade oral4 que contêm uma proporção predominante de DNA humano para bacteriano. No entanto, em amostras com baixas concentrações de DNA bacteriano ou aquelas “contaminadas” pelo DNA do hospedeiro, como sangue, urina ou amostras de biópsia humana, o perfil do bacterioma ainda depende em grande parte do sequenciamento do gene 16S rRNA. Como a quantidade de dados gerados é relativamente pequena, não requer análises bioinformáticas complexas5 e o preço também é mais acessível. Por outro lado, os resultados do sequenciamento do amplicon 16S rRNA são criticamente dependentes da escolha de sub-regiões hipervariáveis ​​das nove regiões variáveis ​​disponíveis intercaladas ao longo da sequência altamente conservada do gene 16S rRNA, como a qualidade da informação recuperada, bem como a taxonomia a precisão pode variar significativamente dependendo do(s) conjunto(s) de primer(s) empregado(s)6. Atualmente, a grande maioria dos estudos tem como alvo a região variável única V4, como no protocolo padronizado amplamente adotado do Earth Microbiome Project (EMP)7, ou as regiões variáveis ​​V1-V38 ou V3-V59, como no protocolo de indexação dupla do Human Microbiome. Projeto (HMP). Isso ocorre principalmente porque a plataforma de sequenciamento Illumina amplamente utilizada produz apenas sequências curtas (NextSeq, MiniSeq, iSeq ≤ 300 bases e MiSeq ≤ 600 bases). Infelizmente, estudos recentes mostraram repetidamente que a sub-região V4 do gene 16S rRNA, comumente alvo, avalia os táxons comumente presentes no corpo humano com menos precisão . Além disso, juntamente com a região V3-V5, é particularmente susceptível à amplificação fora do alvo do ADN humano12, especialmente em amostras de biópsia, resultando na perda potencial de táxons raros e na resolução bacteriana, pelo que uma proporção significativa de dados é desperdiçada.

Aqui demonstramos um novo protocolo usando um conjunto de primers direcionado à sub-região do gene V1-V2 16S rRNA que diminui drasticamente a amplificação fora do alvo do DNA humano em amostras de biópsia do esôfago, estômago e duodeno, enquanto aumenta significativamente a diversidade alfa e taxonômica precisão em comparação com os primers comumente usados ​​visando a região V4. Os primers de amplificação para a região V1-V2, incluindo funcionalidades necessárias para sequenciamento (adaptadores de células de fluxo e índices), foram otimizados para a plataforma Illumina MiniSeq com comprimento máximo de leitura de 150 pb, oferecendo uma opção econômica para qualquer laboratório interessado em realizar sequenciamento do gene 16S rRNA de alto rendimento. Para aumentar ainda mais o desempenho das classificações taxonômicas, incluímos a concatenação de leituras emparelhadas no pipeline de bioinformática .