Geração de um vírus Saffold recombinante expressando UnaG como marcador para visualização de infecção viral

Virology Journal volume 20, número do artigo: 175 (2023) Citar este artigo

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O vírus Saffold (SAFV), que pertence ao gênero Cardiovirus da família Picornaviridae, está associado a doenças respiratórias ou gastrointestinais agudas em crianças; também é suspeito de causar doenças graves, como paralisia flácida aguda e meningite asséptica. Porém, a compreensão do mecanismo de sua patogenicidade ainda é limitada devido às muitas incógnitas sobre seu ciclo de vida; por exemplo, o receptor celular para a sua infecção continua por determinar. É necessário um sistema para monitorar a infecção pelo SAFV in vitro e in vivo, a fim de acelerar a pesquisa sobre o SAFV.

Geramos um SAFV recombinante expressando proteína fluorescente verde (GFP) ou UnaG, uma nova proteína fluorescente derivada da enguia japonesa. Células HeLa infectadas por SAFV que expressa GFP ou UnaG mostraram um sinal fluorescente verde brilhante, permitindo o monitoramento conveniente da infecção por SAFV. No entanto, a expressão de GFP, mas não de UnaG, foi rapidamente perdida durante a passagem do vírus devido à diferença na estabilidade genética no genoma do vírus SAFV; o gene UnaG foi mantido de forma estável no genoma do vírus após pelo menos cinco passagens.

A infecção por SAFV de células cultivadas pode ser facilmente monitorada usando SAFV que expressa UnaG, que é superior ao GFP em termos de estabilidade genética no genoma do vírus. Este vírus pode ser uma ferramenta útil para a pesquisa do SAFV, como a comparação da suscetibilidade de várias células à infecção pelo SAFV e a avaliação dos efeitos dos antivirais na infecção pelo SAFV na triagem de alto rendimento.

O vírus Saffold (SAFV) pertence ao gênero Cardiovirus da família Picornaviridae, que é uma partícula pequena, não envelopada e icosaédrica com um genoma de RNA de fita simples de sentido positivo. O SAFV foi descoberto como o primeiro cardiovírus humano em 2007 nas fezes de uma criança apresentando febre de origem desconhecida em 1981 [1]. Desde então, foi relatada a detecção de SAFV em crianças que sofrem de doenças respiratórias agudas ou gastrointestinais [2,3,4,5,6]. Além disso, SAFVs foram detectados em amostras de pacientes com doenças graves (por exemplo, paralisia flácida aguda, meningite asséptica, miocardite, pancreatite aguda e cerebelite) [7,8,9,10,11]. No entanto, a patogenicidade do SAFV, que causa uma variedade de sintomas ligeiros a graves, permanece obscura. O uso de um SAFV recombinante contendo um gene repórter, como a proteína fluorescente verde (GFP), que permite o monitoramento conveniente e em tempo real da replicação do SAFV in vitro e in vivo, seria muito benéfico para elucidar o mecanismo de patogenicidade do SAFV.

O genoma do SAFV consiste em um longo quadro de leitura aberto (ORF), regiões não traduzidas 5' e 3' (UTR) e um comprimento variável de cauda poli (A) na UTR 3'. A ORF codifica uma proteína líder (L), quatro proteínas do capsídeo (VP1 a VP4) e sete proteínas não estruturais (2 A, 2B, 2 C, 3 A, 3B, 3 C e 3D) [1]. A poliproteína é traduzida a partir da ORF e depois processada pela protease 3 C em proteínas virais maduras pós-tradução, enquanto a separação co-tradução da poliproteína ocorre no motivo StopGo. Este motivo é o oligopeptídeo D (V/I) ExNPG | P (onde “|” representa a junção entre 2 A e 2B) mediando o processo StopGo [12, 13] e é conservado na junção 2 A/2B do SAFV (DIETNPG|P) [14]. O processo StopGo também tem sido referido como “salto ribossômico” ou “Stop-Carry On” e evita a formação de uma ligação peptídica entre a glicina e a prolina, mas permite a continuação da tradução.

Para avançar nos estudos patogenéticos moleculares do SAFV usando genética reversa, estabelecemos previamente um clone infeccioso de cDNA do SAFV-3 (a cepa JPN08-404) [8]. No presente estudo, com base neste clone de cDNA, geramos dois SAFVs recombinantes expressando um gene repórter, GFP ou UnaG, para detectar prontamente a infecção em células vivas, inserindo-as entre 2 A e 2B usando o motivo StopGo. UnaG é uma nova proteína verde fluorescente derivada da enguia japonesa [15], que, com 139 aminoácidos, é menor em tamanho em comparação com a GFP (239 aminoácidos). No presente estudo, demonstramos que o UnaG é um marcador superior para infecção por SAFV ao GFP no que diz respeito à estabilidade genômica do genoma do vírus. Mostramos ainda a utilidade do SAFV que expressa UnaG para o estudo da infecção por SAFV e a triagem de medicamentos antivirais.