Detecção molecular de espécies humanas de Plasmodium usando PCR multiplex em tempo real

Scientific Reports volume 13, Artigo número: 11388 (2023) Citar este artigo

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Os métodos de detecção molecular revelaram maior sensibilidade e especificidade do que a microscopia convencional ou os testes de diagnóstico rápido para o diagnóstico da malária. Neste estudo, implementamos, avaliamos e validamos de acordo com os requisitos da ISO 15.189, um ensaio PCR multiplex em tempo real para detectar e identificar os cinco parasitas da malária humana. Amostras de DNA foram extraídas de sangue total ou de sangue seco retirado de pacientes. Baseado na Avaliação Externa da Qualidade (sangue total), este método apresenta 100% de sensibilidade e especificidade. Esta PCR detectou P. vivax até 0,25 p/µl, P. falciparum e P. knowlesi até 0,5 p/µl, P. ovale até 1 p/µl e P. malariae até 5 p/µl de sangue. A partir de manchas de sangue (extração de quatro punches), detectou P. vivax a 5 p/µl, P. falciparum, P. ovale e P. knowlesi a 20 p/µl e P. malariae a 125 p/µl. Concluindo, este PCR quantitativo apresenta excelente desempenho, é fácil de usar e economiza DNA. É especialmente útil rastrear activamente grandes grupos populacionais e identificar os cinco parasitas humanos da malária num contexto de baixa transmissão da malária.

A malária é uma das doenças mais mortais e já ceifou milhões de vidas em todo o mundo, 619.000 em 20211. Esta doença transmitida por vectores é causada em humanos por cinco espécies diferentes do género Plasmodium, P. falciparum, P. vivax, P. malariae , P. ovale e P. knowlesi2. A última foi recentemente transmitida aos seres humanos por primatas na Malásia3. P. falciparum gera a maior taxa de mortalidade e morbidade. Contudo, o P. vivax é o mais amplamente distribuído em todas as áreas endémicas e o segundo maior contribuinte para a malária clínica em todo o mundo1. Esta espécie foi originalmente considerada benigna, mas agora é reconhecida como causa de grave morbidade e mortalidade4,5. O diagnóstico preciso da malária é crucial para reduzir o tratamento presuntivo. A microscopia é a principal ferramenta para diagnosticar a malária juntamente com os testes de diagnóstico rápido (RDT). Suas atuações permitem o diagnóstico de pacientes com parasitemia de até 10 parasitas/µl de sangue. Devido às suas sensibilidades, limitam-se a identificar portadores assintomáticos e com baixa parasitemia. No entanto, abordar estes reservatórios de parasitas é crucial para que os programas nacionais da malária avancem na eliminação da malária. Estes programas exigem novos métodos de diagnóstico, altamente sensíveis, mas economicamente eficazes, para rastrear activamente grandes grupos populacionais6.

A amplificação molecular da pequena subunidade 18S do RNA ribossômico (18S rRNA), implementada pela primeira vez por Snounou et al. usando uma técnica de nested PCR, é a ferramenta de diagnóstico molecular mais amplamente utilizada em laboratórios médicos ou em programas de pesquisa7,8. O gene 18S rRNA é comumente o alvo devido às suas 5 a 7 cópias por genoma, o que aumenta a sensibilidade9. Também é conservado em todas as espécies de Plasmodium com partes específicas para cada uma delas.

Desde então, as técnicas moleculares evoluíram e agora incluem PCR em tempo real, PCR com transcriptase reversa, amplificação baseada em sequência de ácido nucléico (NASBA) e LAMP (amplificação isotérmica mediada por loop). Estas PCR podem detectar uma ampla gama de alvos genéticos e são 10 a 100 vezes mais sensíveis que a microscopia10,11. Em comparação com o nested-PCR original, eles também fornecem resultados mais rapidamente (dentro de uma hora em comparação com 4,5–10 horas).

Neste estudo, desenvolvemos e avaliamos um procedimento de PCR multiplex em tempo real sensível e específico para detectar e identificar os cinco parasitas da malária transmitidos aos humanos (P. falciparum, P. vivax, P. malaria, P. ovale e P. knowlesi) . Adaptado de Shokoples et al.12 e de Canale et al.13, foram implementadas duas PCR multiplex em tempo real, uma visando P. falciparum e P. vivax e outra visando P. malariae, P. ovale e P. knowlesi. A abordagem multiplex foi escolhida para minimizar o consumo de DNA, tempo e dinheiro. A extração de DNA foi padronizada e controlada usando um terceiro PCR simplex direcionado ao gene da macroglobulina humana. Se for necessária uma triagem rápida e ampla durante a detecção ativa de casos, também implementamos um Plasmodium spp. Método de PCR adaptado de Hassanpour et al.14. Esses métodos foram credenciados de acordo com a norma de biologia médica ISO 15.189 para analisar DNA extraído de sangue venoso ou capilar.